Identifikation af bakterier er en kompleks proces. Dette er dels fordi der er så mange typer estimater af antallet af arter spænder fra omkring 10.000 til over en milliard![1] At kunne identificere bakterier korrekt er særlig vigtigt i kliniske indstillinger, da passende behandling kan afhænge af, hvilken type bakterier der forårsager en infektion. I de fleste tilfælde er identifikation af bakterier en proces med eliminering. For at identificere bakterier skal du bruge farvningsteknikker, bemærke bakteriens udseende og observere, hvordan bakterierne reagerer på forskellige forhold. For hurtigt at bestemme de nøjagtige arter af bakterier, send en prøve til DNA-testning.

Metode En af fire:
Identifikation af bakterier med gramfarvning

  1. 1 Brug Gramfarvning for at se om bakterier er Gram-positive eller Gram-negative. Gramfarvning er en procedure, der giver dig mulighed for at opdele bakterier i 2 almindelige typer: Gram positiv og Gram-negativ. Gram positive bakterier har en ekstra tyk cellulær væg (lavet af en polymer kaldet peptidoglycan), der har en farvefarve bedre end de tyndere cellevægge af gramnegative bakterier.[2]
    • Common Gram positive bacteria genera inkluderer Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus og Listeria.[3]
    • Fælles Gram-negativ bakterie-genera indbefatter Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter og Fusobacterium.[4]
  2. 2 Brug sikkerhedsforanstaltninger. De bakterier og kemikalier, som du vil håndtere under en Gram-farveprocedure, er alle potentielt farlige. Brug beskyttelsesbriller, engangs nitrilhandsker og en lab coat under udførelse af pletten. Sæt dine engroshandsker og andre forurenede affaldsmaterialer i en biohazard taske, når du er færdig. Følg laboratoriets procedurer for bortskaffelse af biohazard tasken.[5]
  3. 3 Lav et dias af din bakterieprøve. For at starte processen skal du placere en lille dråbe eller et stykke af din bakterieprøve på et sterilt objektglas. Før glideren gennem en Bunsen-brænders flamme 3 gange for at opvarme prøven.[6] Dette forhindrer prøven i at vaske væk, når du tilføjer reagenser eller skyller objektivet.
  4. 4 Tilføj 5 dråber krystal violet til dias. Placer dråberne af krystal violet farvestof på den varme-fikserede kultur. Lad prøven sive i krystal violet farvestof i 1 minut.[7]
    • For at undgå at plette din hånd, kan du ønske at holde glideren på plads med en tøjstift.[8]
  5. 5 Skyl forsigtigt glideren for at fjerne pletten. Brug en meget blid vandstrøm fra en vask eller sprøjteflaske. Skyl ikke i mere end 5 sekunder.[9] Denne proces fjerner ethvert farvestof, som ikke er bundet til prøven.
  6. 6 Tilsæt 5 dråber grams jod til diaset. Grams jod er en opløsning af jod, kaliumiodid og natriumbicarbonat.[10] Denne løsning vil medføre, at krystalvioletfarvet bliver fusioneret til bakteriens cellevægge. Tilsæt ca. 5 dråber, og lad det sidde i 1 minut.[11]
  7. 7 Skyl prøven med alkohol eller acetone. Alkohol og acetone er affarvningsmidler. Hvis dine bakterier er en Gram-negativ stamme, vil disse midler fjerne pletten fra bakteriecellevæggene. Lad et par dråber af affarvningsmidlet dryppe over prøven, og lad det sidde i mere end 3 sekunder. Skyl forsigtigt med vand i mere end 5 sekunder for at fjerne alkoholen eller acetonen.[12]
    • Hvis du lader affarvningsmidlet sidde på prøven for længe, ​​kan det fjerne strimlen fra Gram-positive bakterier, hvilket giver et falsk Gram-negativt resultat.
  8. 8 Modstå opløsningen med safranin. Safranin er et rødt farvestof, som vil virke som et modstykke til krystalviolen og farve enhver bakterie, der ikke har den violette plet. Tilsæt ca. 5 dråber safraninopløsning til prøven, og lad den sidde i 1 minut. Skyl meget forsigtigt med vand i 5 sekunder.[13]
  9. 9 Se din prøve under mikroskopet ved 1000X forstørrelse. Hvis bakterierne er en Gram-positiv stamme, vises de lilla eller violette under mikroskopet. Gramnegative bakterier vises rødt fra safranin-modstanden.[14]

Metode To af fire:
Brug af Ziehl-Neelsen Stain Technique

  1. 1 Brug Ziehl-Neelsen-farvning til at detektere syrefaste bakterier. Syrefaste bakterier indeholder en højere mængde lipid end andre typer bakterier, hvilket gør dem resistente over for farvestofferne, der anvendes til Gram-farvning. Syrefaste bakterier tilhører slægten Mycobacterium, som omfatter bakterien, der forårsager tuberkulose (M. tuberculosis). Syrefaste bakterier kan farves med et rødt carbol-fuchsin-farvestof, som vil modstå at blive skyllet ud med en syrealkohol eller svovlsyreopløsning.[15]
  2. 2 Tag passende sikkerhedsforanstaltninger. De kemikalier og biologiske materialer, der anvendes under en Ziehl-Neelsen-farvningsprocedure, kan være farlige. Du vil også bruge varmekilder, som f.eks. En Bunsen-brænder, åndelampe eller el-varmelegeme. Tag følgende forholdsregler under udførelse af denne procedure:[16]
    • Brug beskyttelsesbriller, nitrilhandsker og en lab coat.[17]
    • Pas på ikke at indånde nogen røg fra farvnings- og affarvningsopløsningerne eller få dem på din hud eller i dine øjne. Opbevar eventuelle åbne beholdere under en dampplade.[18]
    • Vær forsigtig, når du opvarmer dit dias, da mange af de kemikalier, du vil bruge, er brandfarlige. Der kan også være spor af brandfarlige kemikalier på glidestænger og andet udstyr.[19]
  3. 3 Klargør et dias. Spred et udsnit af din prøve jævnt over midten af ​​et sterilt objektglas med cirkulære bevægelser. Dit udsmykning skal være omkring 10 mm med 20 mm (0,8 tommer).[20]
  4. 4 Tør dit dias. Placér diaset på en tørreholders smøre side opad. Lad det lufttørre i 30 minutter.[21] Forsøg ikke at blæse sliden tørre.
  5. 5 Varmesæt dit smør. Du kan opvarme prøven ved at føre glideren over en Bunsen-brænders flamme 2-3 gange, så den smøres op.Alternativt kan du sætte glideren på en elektrisk glidevarmer ved 65 ° -75 ° C i mindst 2 timer.[22] Pas på, at du ikke brænder eller koger prøven.
  6. 6 Tilføj carbol-fuchsin plet til dit dias. Sæt flere dråber carbol-fuchsin-opløsning på diaset. Tilsæt nok til helt at dække smøret.[23]
  7. 7 Varm farvede dias for at fixe pletten til smeden. Varm forsigtigt glideren over en Bunsen-brænder eller åndelampe, smør side op, eller sæt den på en elektrisk lysvarmer. Varm skyderen, indtil den når 60 ° C (140 ° F). Du bør se damp begynde at stige. Lad den opvarmede plet sidde på lysbilledet i 5 minutter.[24]
    • Hvis du bruger en elektrisk diasvarmer, skal du indstille den til 60 ° C (140 ° F). Hvis du bruger en Bunsen-brænder eller åndelampe, skal du være opmærksom på udseendet af damp eller damp.
    • For at holde lysbilledet ved den ønskede temperatur i en fuld 5 minutter, skal varme indstilles intermitterende.[25]
    • Pas på ikke at koge, scorch eller helt tørre dit farvede smear.
  8. 8 Skyl glideren med køligt vand. Lad glideren afkøle i ca. 5 minutter, og skyll meget forsigtigt i nogle sekunder med rent vand fra en tryk- eller klemflaske for at fjerne enhver plet, der ikke er bundet til prøven.[26]
  9. 9 Dæk smøret med sur alkohol eller svovlsyre. Tilsæt nok 3% volumen over volumen (volumen / volumen) syrealkohol eller 20% svovlsyre for fuldstændigt at dække smøret. Lad syren stå på lysbilledet, indtil pletten er falmet til en meget lyserød.[27] Dette tager normalt mindst 10 minutter.[28]
  10. 10 Skyl objektglasset med rent vand. Skyl forsigtigt med vand fra en tryk- eller klemflaske, og sørg for at vaske hele syren og eventuelle rester af farve tilbage.[29]
  11. 11 Tilføj modstand til diaset. Når glideren er skyllet, skal du dække din plet med malachitgrøn eller Loefflers methylenblå opløsning. Disse løsninger skaber en grøn eller blå "baggrund", der hjælper de rødfarvede bakterier skiller sig ud, og vil også plette ethvert andet biologisk materiale på diaset (såsom humane celler og bakterier, der ikke er syrefaste). Lad pletten stå i 1-2 minutter.[30]
  12. 12 Skyl og tør ridsen. Vask glidestykket forsigtigt med rent vand for at fjerne overskydende modstand. Når du er færdig, skal du tørre bagsiden af ​​diaset med en ren klud og læg glideren på et stativ for at lufttørre.[31]
  13. 13 Undersøg diaset under et mikroskop ved 1000X forstørrelse. Syrefaste bakterier skal forekomme rød eller varm rosa. Ikke-sure-faste bakterier, ikke-bakterielle celler og baggrunden vises blå eller grøn.[32]

Metode Tre af fire:
Observation af bakteriel udseende og adfærd

  1. 1 Overhold bakteriens form. Når du har brugt farvning for at bestemme, om dine bakterier er Gram-positive, Gram-negative eller syrefaste, er det tid til at indsnævre typen af ​​bakterier. Det første skridt er at observere formen (e) af bakterierne på diaset. De 3 mest almindelige former er coccus (sfærisk), bacillus (stangformet) og spiral.[33]
    • Der er mange variationer på alle disse former. For eksempel kan coccus bakterier forekomme i forskellige formationer, såsom fusionerede par (diplococcus), kæder, klynger eller grupper af 4 (tetrads).
  2. 2 Bestem om bakterierne er aerob eller anaerobe. Tag 2 prøver af bakterierne og opret 2 separate kulturer. 1 kultur bør være anaerob (dyrket uden ilt) og den anden bør være aerob (dyrket med ilt). Opbevar din anaerobe kultur i et iltfrit miljø ved 35 ° C (95 ° F) i mindst 48 timer, før du forsøger at observere bakterievækst.[34]
    • Hvis dine bakterier vokser i det iltfrie miljø, men ikke når de er udsat for ilt, er de anaerobe.
    • Bakterier, der vokser, når de udsættes for ilt, men ikke når de holdes i et iltfri miljø, er aerob.
    • Bakterier der kan vokse i begge miljøer kaldes fakultative anaerober.
  3. 3 Lav en motilitetstest for at finde ud af, om dine bakterier er motile. Motile bakterier kan bevæge sig selv ved at bruge 1 eller flere flagella til at fremdrive sig selv. Motilitet, eller manglende bevægelighed, kan være en vigtig faktor ved identifikation af en bakteriebelastning.[35] Der er flere typer af motilitetstest, men den halvfaste medietest er den sikreste og nemmeste at læse.
  4. 4 Lav en kultur til din motilitetstest. Forbered en bakterie af bakterier i en næringsmedium. Forbered bouillon i henhold til anvisningerne for dit foretrukne bouillonmedium.[36]
  5. 5 Inokulere et rør med halvfast motilitetsagar med din kultur. Coat en steril inokuleringsnål med nogle af bouillonkulturen. Stik forsigtigt nålen lige ind i et rør af halvfast agar formuleret til motilitetstestning (såsom TTC-agar). Nålen skal gå omkring 2/3 af vejen ind i agar.[37]
    • Når du er færdig, skal du forsigtigt trække nålen ud, og pas på ikke at bryde den oprindelige "stablinie".
    • Inkuber røret ved 30 ° C (86 ° F) i 48 timer.[38]
  6. 6 Læs resultaterne af motilitetstesten. Motilitetsagar bliver rød, når den kommer i kontakt med bakterier. Hvis dine bakterier er motile, vil en rød eller lyserød farve blive diffunderet gennem agar. Hvis de ikke er motile, vil du kun se den røde farve langs den oprindelige stødlinie.[39]

Metode Fire af Fire:
Samler det hele

  1. 1 Sæt dine observationer sammen. For at indsnævre bakteriens genus skal du kombinere oplysningerne fra dine pletter, kulturer og observationer af bakterieform. Hvis du tester en kultur fra en patient, kan oplysninger om deres symptomer også være nyttige til indsnævring af feltet.[40]
    • For eksempel, hvis dine tests afslører, at dine bakterier er gramnegative, anaerobe, ikke-motile baciller, og de er forbundet med mavesmerter, kvalme og opkastning i patienten, er de sandsynligvis Bacteroides fragilis.[41]
  2. 2 Konsulter en database med bakterier. Da der er så mange arter af bakterier, er det umuligt at huske eller genkende dem alle alene. Du skal nok høre en klinisk mikrobiologi lærebog eller en online database og søge efter bakterier med alle dine egenskaber.
    • Gode ​​online ressourcer til at identificere bakterier omfatter Pathosystems Resource Integration Center (patricbrc.org) og den patogene bakterie database på GlobalRPh (globalrph.com/bacterial-strains.htm).
  3. 3 Brug genetisk test til at bestemme de nøjagtige arter af bakterier. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at identificere de nøjagtige arter af bakterier. Den hurtigste og mest effektive måde at gøre dette på er med DNA-test. DNA-test er også nyttig til at identificere bakterier, som modstår traditionelle former for dyrkning eller farvning.[42] Moderne mikrobiell DNA-test kan gøres meget hurtigt, nogle gange på så lidt som 2 timer.[43]
    • Hvis du ikke har adgang til et laboratorium, der gør mikrobiel genom sekventering, skal du sende en prøve til en specialist facilitet, såsom MIDI Labs eller CD Genomics.